原创 骄阳似我 图灵基因 2022-07-06 08:03 发表于江苏
收录于合集#前沿分子生物学机制
撰文：骄阳似我
IF=31.743
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亮点：
T细胞衰竭限制了抗肿瘤免疫，但这一过程的分子机制尚不清楚。本文进行了全基因组CRISPR-Cas9筛选，以系统地发现T细胞耗竭的调节因子，从而确定了表观遗传因子的富集。小鼠和人类肿瘤模型的体内CRISPR筛选表明，INO80和BAF染色质重塑复合物的扰动改善了肿瘤中T细胞的持久性。体内扰动序列揭示了每个复合物的不同转录作用，包括Arid1a在内的典型BAF复合物成员的缺失导致效应程序的维持和肿瘤浸润T细胞中耗竭相关基因的下调。最后，Arid1a耗竭限制了耗竭相关chromatin可及性的获得，并导致抗肿瘤免疫的改善。总之，本文提供了一个T细胞耗竭的遗传调节器图谱，并证明表观遗传状态的调节可以改善癌症免疫治疗中的T细胞反应。
T细胞衰竭是一个由慢性T细胞受体（TCR）刺激驱动的过程，导致抑制性表面受体的稳定表达、对肿瘤抗原的反应性差、细胞增殖和体内持久性低。T细胞衰竭最初是在慢性病毒感染的情况下发现的，现在被认为发生在各种疾病环境中，包括癌症和自身免疫性疾病。研究表明，T细胞衰竭是检查点阻断和嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞免疫治疗的主要障碍，操纵这一过程可能会提高T细胞对癌症的反应效率。
CRISPR-Cas9筛选已成为发现免疫细胞分化和功能分子决定因素的有力工具。例如，先前T细胞中的CRISPR-Cas9筛选已用于识别体内T细胞命运的转录因子和代谢调节因子以及治疗靶点。然而，扩大这些体内分析的固有局限性限制了这些筛选的文库多样性，在很大程度上阻碍了全基因组分析和T细胞表型新调节因子的公正发现。此外，同时筛选T细胞多种功能（例如，肿瘤中的组织定位、浸润和分化）的分析也使得质疑特定基因扰动对T细胞功能和表型的单一方面的影响（例如耗尽）变得具有挑战性。
近期，在
Cancer cell
杂志上发表了一篇名为「
Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence
」的文章，开发了CD8+T细胞衰竭的体外模型，该模型概括了在体内观察到的衰竭的表观基因组特征，并可用于全基因组CRISPR-Cas9筛查。利用这个模型可筛选出对T细胞衰竭的遗传调节因子，结果表明通过染色质重塑因子调节T细胞耗竭的表观遗传状态可能是改善癌症免疫治疗中T细胞反应的有效途径。
体外慢性刺激试验再现了终末T细胞衰竭的表观遗传学程序
为了开发一种适用于全基因组CRISPR Cas9筛查T细胞衰竭的分析方法，本文使用抗CD3抗体来加强T细胞共受体CD3的聚集，从而以非抗原依赖的方式诱导慢性TCR信号。该模型通过TCR复合物分离出T细胞衰竭慢性刺激的核心决定因素，并消除T细胞定位和转运效应以及肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制因子。在8天的抗CD3刺激过程中（抗CD3/CD28激活2天后），抑制性受体PD-1和T细胞免疫球蛋白域和粘蛋白域3（TIM3）逐步上调，慢性刺激T细胞生长缺陷。接下来探究体外耗竭试验是否再现了体内T细胞耗竭的表观遗传学特征。在慢性刺激过程中进行转座酶可及性染色质测序分析（ATAC-seq），并分析染色质可及性图谱。结果表明，体外T细胞衰竭试验显示出体内T细胞衰竭的标志性功能和基因组特征。图1：体外慢性抗原刺激试验重现了T细胞衰竭的表观遗传学特征。
全基因组CRISPR筛选识别T细胞衰竭的遗传调节因子
接下来调整体外耗竭试验使其与CRISPR筛选适配。从Rosa26-Cas9敲除小鼠中分离出CD8+T细胞，用含有90230个sgRNA的全基因组逆转录病毒sgRNA文库转导细胞，在第4天将细胞分裂为急性（仅IL-2）和慢性（抗CD3和IL-2）刺激条件，并在第10天进行测序。筛查的阳性对照是TCR信号通路的组成部分，因为这些因子的缺失会损害抗原驱动（或抗CD3驱动）信号。因此，首先分析了CD3受体亚单位（Cd3e、Cd3d、Cd3g、Cd247）的富集情况，观察到在两个重复中针对这些基因的导向物的强烈富集。除了Cd3e、Cd3d和Cd3g外，筛选中的顶级富集基因还包括TCR信号通路的其他已知成分，如Zap70、Lcp2、Lat和Lck，以及细胞粘附和整合素相关基因Fermt3、Tln1、Itgav和Itgb3。对前100名衰竭阳性调节因子的GO分析证实，「TCR信号通路」高度富集。除了与TCR相关的GO分类外，其他与表观遗传学相关，包括「染色质重塑」和「核小体解体」也高度富集。事实上，对其他高富集基因的分析确定了许多染色质相关因子，包括Arid1a、Smarcc1、Smarcd2、Ino80、Actr8和Actr5。值得注意的是，共刺激和抑制受体Icos、Pdcd1、Ctla4、Cd28、Havcr2、Lag3和Tigit在屏幕上没有明显富集。在TFs中，Irf4、Junb、Eomes和Batf3被耗尽，而Tbx21和Nr4a3被耗尽适度丰富，支持之前关于其在疲劳中作用的证明。相比之下，对于衰竭的发展至关重要的Tox和Tox2并不是攻击，这支持了之前的研究证明删除这些因子可能不会改善体内T细胞的持久性。同样，Jun和Batf也没有命中，这表明虽然这些因子的过度表达可以提高T细胞的持久性，但缺失没有显著影响。总之，体外全基因组CRISPR-Cas9耗竭筛查提供了控制慢性抗原诱导T细胞耗竭过程的遗传因子的全面目录，并将染色质重塑因子确定为改善T细胞持久性的潜在靶点。图2：T细胞衰竭的全基因组功能筛选。
染色质重塑因子限制T细胞在体内外的持久性
为了表征top hits的体内功能，在两种小鼠肿瘤模型中筛选sgRNA。第0天双侧注射MC-38结肠腺癌或B16黑色素瘤肿瘤，将卵清蛋白异位表达到Rag1-/-小鼠中，并从Cas9/OT-1小鼠中分离出CD8+T细胞。第1天用定制的sgRNA转导T细胞。在肿瘤接种后6天，每只小鼠移植13106个T细胞，在第15天采集小鼠的肿瘤和脾脏，从每个器官中分离T细胞，并对这些细胞中的大量sgRNA含量进行测序。如上所述计算sgRNA富集度，并合并所有小鼠的结果，创建每个肿瘤模型中每个基因相对于对照分布的总肿瘤LFC Z得分和脾脏LFC Z得分。含有TCR复合物/信号sgRNAs的细胞识别抗原的能力应受损，因此，与体外筛选相比，除了Itk外，其他细胞在体内被耗尽。然而，在两种肿瘤模型中，一组选定的体外HIT在肿瘤和脾脏中高度富集，包括Arid1a、Itk、Smarcd2、B4GALT1、Gata3、Gpr137c、Trp53和Vstm4。在细胞景观网络的背景下可视化每个基因的肿瘤富集显示，体内的许多阳性命中是表观遗传因素，包括INO80复合物（Ino80c和Actr5）的亚单位和BAF复合物（Arid1a、Smarcd2和Smarcc1）。排名靠前的基因敲除可将肿瘤中的T细胞累积提高3.4倍。相比之下，缺乏Cd3d的T细胞减少了6.7倍，缺乏Cd3e的T细胞减少了3.3倍，这表明靶向顶部命中显著提高了T细胞在肿瘤中的持久性。这些结果验证了全基因组筛查，确定了仅在慢性抗原刺激条件下改善T细胞持久性的干扰，而不是改善一般T细胞适应性，并提名BAF和INO80复合物进行进一步研究。图3：靶向体内筛选识别限制T细胞持久性的INO80和BAF复合物的亚单位。
调节cBAF活性可增强T细胞的持久性并改善肿瘤控制
接下来验证Arid1a sgRNA细胞的持久性优势，使用了一种细胞竞争试验，其中细胞被单一靶向对照（CTRL1）sgRNA或Arid1a靶向sgRNA与不同荧光报告物转化，混合，然后放入体外慢性刺激试验或体内MC-38肿瘤模型。在体外和体内，与对照细胞相比，Arid1a sgRNA细胞表现出显著增强的持久性。体外慢性刺激后，Arid1a sgRNA细胞表现出较低的PD-1和TIM3表面蛋白表达。最后评估了观察到的Arid1a sgRNA细胞持续性增强是否会改善体内的抗肿瘤反应。将MC-38肿瘤接种小鼠，并在第6天移植用CTRL1逆转录病毒或Arid1a sgRNA逆转录病毒转导的Cas9/OT-1 CD8+T细胞并监测肿瘤生长。到第15天，与对照细胞的转移相比，Arid1a sgRNA细胞的转移显著改善了肿瘤清除率。与接受CTRL1 T细胞的小鼠相比，接受Arid1a sgRNA T细胞的小鼠的生存期显著延长，三个最重要的命中部位位于cBAF复合体（Arid1a、Smarcc1和Smarcd2）中。相反，BAF核心不可替代亚单位的扰动或ATP酶模块成分有害，导致这些sgRNAs的耗尽。因此提出一个模型，调节（减少）染色质上cBAF的存在有利于T细胞的持久性。研究表明，ARID1A缺陷肿瘤染色质上的cBAF复合物水平降低（但未被清除），这导致关键转录因子（包括AP-1因子）的获取减少。除cBAF外，还观察到以PBAF复合物成员Arid2为靶点的sgRNAs正富集，而以ncBAF复合物成员Bicral、Bicra和Brd9为靶点的sgRNAs严重缺失。综上所述，这些结果表明，扰动cBAF复合亚基基因可以改善T细胞的持久性和体内抗肿瘤免疫。图4：CRISPR筛选和功能研究表明，调节cBAF活性可以增强抗肿瘤免疫。
体内扰动序列揭示TIL中染色质重塑复合物的不同转录效应
为了理解CRISPR筛选识别的hits中促进T细胞功能改善的分子机制，进行了扰动序列分析，该分析同时捕获单个细胞中的CRISPR sgRNAs和转录组。结果表明所有的扰动都包含来自每个簇的细胞，比例相似，表明每个靶基因的缺失可能不会影响细胞类型组成的整体变化，而是调节一个或多个簇中的基因表达。为了进一步研究这种可能性，聚集了含有针对相同基因的sgRNAs的细胞，并计算了与CTRL1细胞相比，每个扰动的不同基因表达，靶向cBAF亚单位Arid1a、Smarcd2或Smarcc1诱导T细胞转录程序中的共同全局变化，包括效应分子Gzmb和Ifng、细胞表面受体Cxcr6和Il7r以及TFs Irf4和Batf的上调。数据表明，cBAF和INO80染色质重塑复合物的亚单位在T细胞衰竭中具有不同的作用，这些作用在同一复合物中基本上是保守的，cBAF主要调节效应器和衰竭相关基因，INO80调节代谢。此外，tar染色质重塑因子的转录影响与先前已知靶点Pdcd1和Gata3的影响重叠最小，这表明有可能协同靶向多种途径以改善T细胞功能。图5：Cbaf缺失的T细胞表现出增强的效应基因特征和减少的末端耗竭。
在这项研究中，在慢性刺激的T细胞中进行了全基因组CRISPR筛查，这提供了调节T细胞衰竭的全面基因图谱。使用了一种互补的体外和体内筛选策略：（1）与全基因组CRISPR筛选兼容的体外耗竭试验的开发，使我们能够与之前的筛选相比，扩大细胞数量和sgRNA文库覆盖范围，提供了一种无偏的发现工具，（2）体内随访筛选发现干扰显著改善了免疫治疗相关肿瘤模型中T细胞的持久性。图6：文章总图。
教授简介：
Ansuman T . Satpathy
Ansuman Sattathy博士是斯坦福大学医学院病理学系的助理教授。他是斯坦福癌症研究所、帕克癌症免疫治疗研究所、免疫学、癌症生物学和生物医学信息学项目Bio-X的成员，也是ChEM-H的教员研究员。Sattathy博士在圣路易斯华盛顿大学获得免疫学硕士和博士学位，在斯坦福医院和诊所获得病理学临床实习，在斯坦福大学进行遗传学博士后培训。Sattathy博士的研究小组专注于开发和应用基因组级技术，以研究健康、感染和癌症中免疫系统的基本特性。
参考文献：
Belk et al., Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence, Cancer Cell (2022),
https://
doi.org/10.1016/j.ccell
.2022.06.001
