▲发布：浙江省健康产品化妆品行业协会
标准号：T/ZHCA 015-2022【化妆品紧致功效评价 斑马鱼幼鱼弹性蛋白基因相对表达量法】
一、前言
【化妆品功效宣称规范】中指出，具有紧致功效的化妆品，可在人体功效评价测试、消费者使用测试和实验室试验三者中任选一种进行测试，出具报告后方可进行功效宣称。
二、 测试文件
化妆品紧致功效评价斑马鱼幼鱼弹性蛋白基因相对表达量法参考了Differential expression of two tropoelastin genes in zebrafish，该文献简单描述了斑马鱼作为含有多个弹性蛋白原基因的物种特殊之处并详细介绍了eln1和eln2基因在时间与空间形成的弹性蛋白原的积累和二者之间的差异。该测试文件由浙江省健康产品化妆品行业协会于2022年4月1日在团体标准信息平台公布标准。
检测原理：
弹性蛋白在真皮蛋白中的占比不到2%，但它对于皮肤弹性的维系起着重要作用：弹性蛋白是皮肤组织中弹性纤维的主要成分，能为肌肤提供结构性支撑，与皮肤的紧致和弹性密切相关。
因此弹性蛋白减少是皮肤松弛、下垂等老化现象的主要原因。弹性蛋白的两种肌肽段分别由基因eln1、eln2编码，这两种基因的表达水平将影响皮肤紧致程度。
而斑马鱼具有与人类高度保守的调控弹性蛋白的基因，通过检测斑马鱼弹性蛋白基因RNA的相对表达量可以评价护肤产品的紧致功效。
三、 标准解读
受精后天数 day post-fertilization：dpf
斑马鱼受精卵受精后的天数
最大耐受浓度maximum tolerated concentration：MTC
5 dpf的斑马鱼幼鱼未出现死亡(无心跳)和其他毒性效应(心包水肿、躯干弯曲、肌肉纹理不清晰、对机械刺激无反应等)的最高浓度
01受试物
试验产品：
紧致化妆品
阳性对照：
20mg/mL肌肽 L-Carnosine，CAS：305-84-0，纯度≥98%，参考【化妆品紧致功效评价斑马鱼幼鱼弹性蛋白基因相对表达量法】T/ZHCA 015-2022 5.4 配制。
02适用范围
仅适用于能溶解于水或能均匀分散成悬浮水溶液的化妆品及其原料进行化妆品紧致功效评价。
03斑马鱼品系
选用野生型AB品系斑马鱼幼鱼
04孵育环境
斑马鱼幼鱼置于六孔细胞培养板中并用铝箔纸包裹培养板面板，在 （28.5±1.0℃） 生化培养箱中避光孵育24h。
05试验流程
① 预试验，用于 确定受试物的MTC ，为正式试验的浓度设置提供参考。
② 受试物处理， 选取发育正常4dpf斑马鱼幼鱼 置于孔板中，添加 3mL受试物 。
③ 到孵育终点后（5dpf）将斑马鱼清洗转移至离心管，用吸水纸吸干水分并保存至-80℃。
④ 按RNA快速提取试剂盒操作说明书进行总RNA提取，后用超微量紫外分光光度计对总RNA浓度进行测定， 要求各测试组在260nm和280nm处的吸光度比值位于1.90-2.20之间。
⑤ 将总RNA建立反转录体系，按反转录试剂盒说明书合成cDNA。
⑥ 按SYBR Green 荧光染料试剂盒说明书设置qPCR反应程序，进行基因扩增。根据不同测试组到达扩增阈值的循环数，计算循环数之差，表征弹性蛋白基因相对表达量。
06试验有效性
① 预试验及正式试验中，空白对照组中 斑马鱼幼鱼死亡率或异常率不得超过10%。
② 正式试验中，阳性对照组相对表达量应大于空白对照组并存在统计学上的显著性差异，且平均值之差必须大于2倍的空白对照组组内标准偏差（SD）。
③ 正式试验中，如果使用了助溶剂，溶剂对照组与空白对照组之间的基因相对表达量就不能存在统计学上的显著性差异。
07受试物浓度设置
根据预试验的结果，确定正式试验的受试物浓度范围，试验最高浓度组不得高于 MTC。根据测试需要，将受试物储备液用标准稀释水以2倍几何级数稀释至3~5个浓度系列。
08统计学分析
算各组试验的平均值（Mean）及标准误差（Standard Error，SE），统计学处理结果用Mean±SE表示。使用SPSS等统计学软件对数据进行方差分析，以空白对照组（或溶剂对照组）作为标准，比较各实验组目的基因相对表达量，P<0.05 表示有显著性差异。
08结果判定
在试验满足有效性的基础上,受试物与空白/溶剂对照相比,如果eln1、eln2的相对表达量显增加(P<0.05),说明受试物在该浓度下具有增加弹性蛋白基因(eln1、eln2)相对表达量的能力,可作为紧致功效评价的证据支撑之一。
四、 服务案例
关于斑马鱼检测
① 非动物：鱼胚胎检测方法属于非动物测试，符合全球关于动物替代测试发展趋势。
② 高通量：具有高通量优势，可快速低成本完成更多检测项目，如原料功效研究，原料筛查，配方甄选等。
③ 可视化：检测方法具有可视化优势，可让消费者直观感知产品的品质。
④ 高效率：与传统检测机构相比，斑马鱼检测更全面，能快速得到检测结果。
⑤ 低成本：相比人体临床或动物实验，斑马鱼检测成本相对较低。
863检测
863检测日化部利用自身优质的实验室运营服务模式、结合完善的技术保障服务，致力于提供化妆品原料及产品的安全性和功效性的科研、标准、咨询、评测和备案服务。通过包括全项人体功效评价试验、消费者使用试验及实验室方法等技术手段，为化妆品企业功效宣传提供科学依据，助力化妆品产品研发、质量提升和升级转型。
