原創 驕陽似我 圖靈基因 2022-07-06 08:03 發表於江蘇
收錄於合集#前沿分子生物學機制
撰文：驕陽似我
IF=31.743
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T細胞衰竭限制了抗腫瘤免疫，但這一過程的分子機制尚不清楚。本文進行了全基因組CRISPR-Cas9篩選，以系統地發現T細胞耗竭的調節因子，從而確定了表觀遺傳因子的富集。小鼠和人類腫瘤模型的體內CRISPR篩選表明，INO80和BAF染色質重塑復合物的擾動改善了腫瘤中T細胞的永續性。體內擾動序列揭示了每個復合物的不同轉錄作用，包括Arid1a在內的典型BAF復合物成員的缺失導致效應程式的維持和腫瘤浸潤T細胞中耗竭相關基因的下調。最後，Arid1a耗竭限制了耗竭相關chromatin可及性的獲得，並導致抗腫瘤免疫的改善。總之，本文提供了一個T細胞耗竭的遺傳調節器圖譜，並證明表觀遺傳狀態的調節可以改善癌癥免疫治療中的T細胞反應。
T細胞衰竭是一個由慢性T細胞受體（TCR）刺激驅動的過程，導致抑制性表面受體的穩定表達、對腫瘤抗原的反應性差、細胞增殖和體內永續性低。T細胞衰竭最初是在慢性病毒感染的情況下發現的，現在被認為發生在各種疾病環境中，包括癌癥和自身免疫性疾病。研究表明，T細胞衰竭是檢查點阻斷和嵌合抗原受體T（CAR-T）細胞免疫治療的主要障礙，操縱這一過程可能會提高T細胞對癌癥的反應效率。
CRISPR-Cas9篩選已成為發現免疫細胞分化和功能分子決定因素的有力工具。例如，先前T細胞中的CRISPR-Cas9篩選已用於辨識體內T細胞命運的轉錄因子和代謝調節因子以及治療靶點。然而，擴大這些體內分析的固有局限性限制了這些篩選的文庫多樣性，在很大程度上阻礙了全基因組分析和T細胞表型新調節因子的公正發現。此外，同時篩選T細胞多種功能（例如，腫瘤中的組織定位、浸潤和分化）的分析也使得質疑特定基因擾動對T細胞功能和表型的單一方面的影響（例如耗盡）變得具有挑戰性。
近期，在
Cancer cell
雜誌上發表了一篇名為「
Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence
」的文章，開發了CD8+T細胞衰竭的體外模型，該模型概括了在體內觀察到的衰竭的表觀基因組特征，並可用於全基因組CRISPR-Cas9篩查。利用這個模型可篩選出對T細胞衰竭的遺傳調節因子，結果表明透過染色質重塑因子調節T細胞耗竭的表觀遺傳狀態可能是改善癌癥免疫治療中T細胞反應的有效途徑。
體外慢性刺激試驗再現了終末T細胞衰竭的表觀遺傳學程式
為了開發一種適用於全基因組CRISPR Cas9篩查T細胞衰竭的分析方法，本文使用抗CD3抗體來加強T細胞共受體CD3的聚集，從而以非抗原依賴的方式誘導慢性TCR訊號。該模型透過TCR復合物分離出T細胞衰竭慢性刺激的核心決定因素，並消除T細胞定位和轉運效應以及腫瘤微環境（TME）中的免疫抑制因子。在8天的抗CD3刺激過程中（抗CD3/CD28啟用2天後），抑制性受體PD-1和T細胞免疫球蛋白域和粘蛋白域3（TIM3）逐步上調，慢性刺激T細胞生長缺陷。接下來探究體外耗竭試驗是否再現了體內T細胞耗竭的表觀遺傳學特征。在慢性刺激過程中進行轉座酶可及性染色質測序分析（ATAC-seq），並分析染色質可及性圖譜。結果表明，體外T細胞衰竭試驗顯示出體內T細胞衰竭的標誌性功能和基因組特征。圖1：體外慢性抗原刺激試驗重現了T細胞衰竭的表觀遺傳學特征。
全基因組CRISPR篩選辨識T細胞衰竭的遺傳調節因子
接下來調整體外耗竭試驗使其與CRISPR篩選適配。從Rosa26-Cas9敲除小鼠中分離出CD8+T細胞，用含有90230個sgRNA的全基因組逆轉錄病毒sgRNA文庫轉導細胞，在第4天將細胞分裂為急性（僅IL-2）和慢性（抗CD3和IL-2）刺激條件，並在第10天進行測序。篩查的陽性對照是TCR訊號通路的組成部份，因為這些因子的缺失會損害抗原驅動（或抗CD3驅動）訊號。因此，首先分析了CD3受體亞單位（Cd3e、Cd3d、Cd3g、Cd247）的富集情況，觀察到在兩個重復中針對這些基因的導向物的強烈富集。除了Cd3e、Cd3d和Cd3g外，篩選中的頂級富集基因還包括TCR訊號通路的其他已知成分，如Zap70、Lcp2、Lat和Lck，以及細胞粘附和整合素相關基因Fermt3、Tln1、Itgav和Itgb3。對前100名衰竭陽性調節因子的GO分析證實，「TCR訊號通路」高度富集。除了與TCR相關的GO分類外，其他與表觀遺傳學相關，包括「染色質重塑」和「核小體解體」也高度富集。事實上，對其他高富集基因的分析確定了許多染色質相關因子，包括Arid1a、Smarcc1、Smarcd2、Ino80、Actr8和Actr5。值得註意的是，共刺激和抑制受體Icos、Pdcd1、Ctla4、Cd28、Havcr2、Lag3和Tigit在螢幕上沒有明顯富集。在TFs中，Irf4、Junb、Eomes和Batf3被耗盡，而Tbx21和Nr4a3被耗盡適度豐富，支持之前關於其在疲勞中作用的證明。相比之下，對於衰竭的發展至關重要的Tox和Tox2並不是攻擊，這支持了之前的研究證明刪除這些因子可能不會改善體內T細胞的永續性。同樣，Jun和Batf也沒有命中，這表明雖然這些因子的過度表達可以提高T細胞的永續性，但缺失沒有顯著影響。總之，體外全基因組CRISPR-Cas9耗竭篩查提供了控制慢性抗原誘導T細胞耗竭過程的遺傳因子的全面目錄，並將染色質重塑因子確定為改善T細胞永續性的潛在靶點。圖2：T細胞衰竭的全基因組功能篩選。
染色質重塑因子限制T細胞在體內外的永續性
為了表征top hits的體內功能，在兩種小鼠腫瘤模型中篩選sgRNA。第0天雙側註射MC-38結腸腺癌或B16黑色素瘤腫瘤，將卵清蛋白異位表達到Rag1-/-小鼠中，並從Cas9/OT-1小鼠中分離出CD8+T細胞。第1天用客製的sgRNA轉導T細胞。在腫瘤接種後6天，每只小鼠移植13106個T細胞，在第15天采集小鼠的腫瘤和脾臟，從每個器官中分離T細胞，並對這些細胞中的大量sgRNA含量進行測序。如上所述計算sgRNA富集度，並合並所有小鼠的結果，建立每個腫瘤模型中每個基因相對於對照分布的總腫瘤LFC Z得分和脾臟LFC Z得分。含有TCR復合物/訊號sgRNAs的細胞辨識抗原的能力應受損，因此，與體外篩選相比，除了Itk外，其他細胞在體內被耗盡。然而，在兩種腫瘤模型中，一組選定的體外HIT在腫瘤和脾臟中高度富集，包括Arid1a、Itk、Smarcd2、B4GALT1、Gata3、Gpr137c、Trp53和Vstm4。在細胞景觀網路的背景下視覺化每個基因的腫瘤富集顯示，體內的許多陽性命中是表觀遺傳因素，包括INO80復合物（Ino80c和Actr5）的亞單位和BAF復合物（Arid1a、Smarcd2和Smarcc1）。排名靠前的基因剔除可將腫瘤中的T細胞累積提高3.4倍。相比之下，缺乏Cd3d的T細胞減少了6.7倍，缺乏Cd3e的T細胞減少了3.3倍，這表明靶向頂部命中顯著提高了T細胞在腫瘤中的永續性。這些結果驗證了全基因組篩查，確定了僅在慢性抗原刺激條件下改善T細胞永續性的幹擾，而不是改善一般T細胞適應力，並提名BAF和INO80復合物進行進一步研究。圖3：靶向體內篩選辨識限制T細胞永續性的INO80和BAF復合物的亞單位。
調節cBAF活性可增強T細胞的永續性並改善腫瘤控制
接下來驗證Arid1a sgRNA細胞的永續性優勢，使用了一種細胞競爭試驗，其中細胞被單一靶向對照（CTRL1）sgRNA或Arid1a靶向sgRNA與不同熒光報告物轉化，混合，然後放入體外慢性刺激試驗或體內MC-38腫瘤模型。在體外和體內，與對照細胞相比，Arid1a sgRNA細胞表現出顯著增強的永續性。體外慢性刺激後，Arid1a sgRNA細胞表現出較低的PD-1和TIM3表面蛋白表達。最後評估了觀察到的Arid1a sgRNA細胞持續性增強是否會改善體內的抗腫瘤反應。將MC-38腫瘤接種小鼠，並在第6天移植用CTRL1逆轉錄病毒或Arid1a sgRNA逆轉錄病毒轉導的Cas9/OT-1 CD8+T細胞並監測腫瘤生長。到第15天，與對照細胞的轉移相比，Arid1a sgRNA細胞的轉移顯著改善了腫瘤清除率。與接受CTRL1 T細胞的小鼠相比，接受Arid1a sgRNA T細胞的小鼠的生存期顯著延長，三個最重要的命中部位位於cBAF復合體（Arid1a、Smarcc1和Smarcd2）中。相反，BAF核心不可替代亞單位的擾動或ATP酶模組成分有害，導致這些sgRNAs的耗盡。因此提出一個模型，調節（減少）染色質上cBAF的存在有利於T細胞的永續性。研究表明，ARID1A缺陷腫瘤染色質上的cBAF復合物水平降低（但未被清除），這導致關鍵轉錄因子（包括AP-1因子）的獲取減少。除cBAF外，還觀察到以PBAF復合物成員Arid2為靶點的sgRNAs正富集，而以ncBAF復合物成員Bicral、Bicra和Brd9為靶點的sgRNAs嚴重缺失。綜上所述，這些結果表明，擾動cBAF復合亞基基因可以改善T細胞的永續性和體內抗腫瘤免疫。圖4：CRISPR篩選和功能研究表明，調節cBAF活性可以增強抗腫瘤免疫。
體內擾動序列揭示TIL中染色質重塑復合物的不同轉錄效應
為了理解CRISPR篩選辨識的hits中促進T細胞功能改善的分子機制，進行了擾動序列分析，該分析同時捕獲單個細胞中的CRISPR sgRNAs和轉錄組。結果表明所有的擾動都包含來自每個簇的細胞，比例相似，表明每個靶基因的缺失可能不會影響細胞型別組成的整體變化，而是調節一個或多個簇中的基因表現。為了進一步研究這種可能性，聚集了含有針對相同基因的sgRNAs的細胞，並計算了與CTRL1細胞相比，每個擾動的不同基因表現，靶向cBAF亞單位Arid1a、Smarcd2或Smarcc1誘導T細胞轉錄程式中的共同全域變化，包括效應分子Gzmb和Ifng、細胞表面受體Cxcr6和Il7r以及TFs Irf4和Batf的上調。數據表明，cBAF和INO80染色質重塑復合物的亞單位在T細胞衰竭中具有不同的作用，這些作用在同一復合物中基本上是保守的，cBAF主要調節效應器和衰竭相關基因，INO80調節代謝。此外，tar染色質重塑因子的轉錄影響與先前已知靶點Pdcd1和Gata3的影響重疊最小，這表明有可能協同靶向多種途徑以改善T細胞功能。圖5：Cbaf缺失的T細胞表現出增強的效應基因特征和減少的末端耗竭。
在這項研究中，在慢性刺激的T細胞中進行了全基因組CRISPR篩查，這提供了調節T細胞衰竭的全面基因圖譜。使用了一種互補的體外和體內篩選策略：（1）與全基因組CRISPR篩選相容的體外耗竭試驗的開發，使我們能夠與之前的篩選相比，擴大細胞數量和sgRNA文庫覆蓋範圍，提供了一種無偏的發現工具，（2）體內隨訪篩選發現幹擾顯著改善了免疫治療相關腫瘤模型中T細胞的永續性。圖6：文章總圖。
教授簡介：
Ansuman T . Satpathy
Ansuman Sattathy博士是史丹佛大學醫學院病理學系的助理教授。他是史丹佛癌癥研究所、帕克癌癥免疫治療研究所、免疫學、癌癥生物學和生物醫學資訊學計畫Bio-X的成員，也是ChEM-H的教員研究員。Sattathy博士在聖路易華盛頓大學獲得免疫學碩士和博士學位，在史丹佛醫院和診所獲得病理學臨床實習，在史丹佛大學進行遺傳學博士後培訓。Sattathy博士的研究小組專註於開發和套用基因組級技術，以研究健康、感染和癌癥中免疫系統的基本特性。
參考文獻：
Belk et al., Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence, Cancer Cell (2022),
https://
doi.org/10.1016/j.ccell
.2022.06.001
