▲釋出：浙江省健康產品化妝品行業協會
標準號：T/ZHCA 015-2022【化妝品緊致功效評價 斑馬魚幼魚彈性蛋白基因相對表達量法】
一、前言
【化妝品功效宣稱規範】中指出，具有緊致功效的化妝品，可在人體功效評價測試、消費者使用測試和實驗室試驗三者中任選一種進行測試，出具報告後方可進行功效宣稱。
二、 測試檔
化妝品緊致功效評價斑馬魚幼魚彈性蛋白基因相對表達量法參考了Differential expression of two tropoelastin genes in zebrafish，該文獻簡單描述了斑馬魚作為含有多個彈性蛋白原基因的物種特殊之處並詳細介紹了eln1和eln2基因在時間與空間形成的彈性蛋白原的積累和二者之間的差異。該測試檔由浙江省健康產品化妝品行業協會於2022年4月1日在團體標準資訊平台公布標準。
檢測原理：
彈性蛋白在真皮蛋白中的占比不到2%，但它對於皮膚彈性的維系起著重要作用：彈性蛋白是皮膚組織中彈性纖維的主要成分，能為肌膚提供結構性支撐，與皮膚的緊致和彈性密切相關。
因此彈性蛋白減少是皮膚松弛、下垂等老化現象的主要原因。彈性蛋白的兩種肌肽段分別由基因eln1、eln2編碼，這兩種基因的表達水平將影響皮膚緊致程度。
而斑馬魚具有與人類高度保守的調控彈性蛋白的基因，透過檢測斑馬魚彈性蛋白基因RNA的相對表達量可以評價護膚產品的緊致功效。
三、 標準解讀
受精後天數 day post-fertilization：dpf
斑馬魚受精卵受精後的天數
最大耐受濃度maximum tolerated concentration：MTC
5 dpf的斑馬魚幼魚未出現死亡(無心跳)和其他毒性效應(心包水腫、軀幹彎曲、肌肉紋理不清晰、對機械刺激無反應等)的最高濃度
01受試物
試驗產品：
緊致化妝品
陽性對照：
20mg/mL肌肽 L-Carnosine，CAS：305-84-0，純度≥98%，參考【化妝品緊致功效評價斑馬魚幼魚彈性蛋白基因相對表達量法】T/ZHCA 015-2022 5.4 配制。
02適用範圍
僅適用於能溶解於水或能均勻分散成懸浮水溶液的化妝品及其原料進行化妝品緊致功效評價。
03斑馬魚品系
選用野生型AB品系斑馬魚幼魚
04孵育環境
斑馬魚幼魚置於六孔細胞培養板中並用鋁箔紙包裹培養板面板，在 （28.5±1.0℃） 生化培養箱中避光孵育24h。
05試驗流程
① 預試驗，用於 確定受試物的MTC ，為正式試驗的濃度設定提供參考。
② 受試物處理， 選取發育正常4dpf斑馬魚幼魚 置於孔板中，添加 3mL受試物 。
③ 到孵育終點後（5dpf）將斑馬魚清洗轉移至離心管，用吸水紙吸幹水分並保存至-80℃。
④ 按RNA快速提取試劑盒操作說明書進行總RNA提取，後用超微量紫外分光光度計對總RNA濃度進行測定， 要求各測試組在260nm和280nm處的吸光度比值位於1.90-2.20之間。
⑤ 將總RNA建立反轉錄體系，按反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。
⑥ 按SYBR Green 熒光染料試劑盒說明書設定qPCR反應程式，進行基因擴增。根據不同測試組到達擴增閾值的迴圈數，計算迴圈數之差，表征彈性蛋白基因相對表達量。
06試驗有效性
① 預試驗及正式試驗中，空白對照組中 斑馬魚幼魚死亡率或異常率不得超過10%。
② 正式試驗中，陽性對照組相對表達量應大於空白對照組並存在統計學上的顯著性差異，且平均值之差必須大於2倍的空白對照組組內標準偏差（SD）。
③ 正式試驗中，如果使用了助溶劑，溶劑對照組與空白對照組之間的基因相對表達量就不能存在統計學上的顯著性差異。
07受試物濃度設定
根據預試驗的結果，確定正式試驗的受試物濃度範圍，試驗最高濃度組不得高於 MTC。根據測試需要，將受試物儲備液用標準稀釋水以2倍幾何級數稀釋至3~5個濃度系列。
08統計學分析
算各組試驗的平均值（Mean）及標準誤差（Standard Error，SE），統計學處理結果用Mean±SE表示。使用SPSS等統計學軟件對數據進行變方分析，以空白對照組（或溶劑對照組）作為標準，比較各實驗組目的基因相對表達量，P<0.05 表示有顯著性差異。
08結果判定
在試驗滿足有效性的基礎上,受試物與空白/溶劑對照相比,如果eln1、eln2的相對表達量顯增加(P<0.05),說明受試物在該濃度下具有增加彈性蛋白基因(eln1、eln2)相對表達量的能力,可作為緊致功效評價的證據支撐之一。
四、 服務案例
關於斑馬魚檢測
① 非動物：魚胚胎檢測方法屬於非動物測試，符合全球關於動物替代測試發展趨勢。
② 高通量：具有高通量優勢，可快速低成本完成更多檢測專案，如原料功效研究，原料篩查，配方甄選等。
③ 視覺化：檢測方法具有視覺化優勢，可讓消費者直觀感知產品的品質。
④ 高效率：與傳統檢測機構相比，斑馬魚檢測更全面，能快速得到檢測結果。
⑤ 低成本：相比人體臨床或動物實驗，斑馬魚檢測成本相對較低。
863檢測
863檢測日化部利用自身優質的實驗室營運服務模式、結合完善的技術保障服務，致力於提供化妝品原料及產品的安全性和功效性的科研、標準、咨詢、評測和備案服務。透過包括全項人體功效評價試驗、消費者使用試驗及實驗室方法等技術手段，為化妝品企業功效宣傳提供科學依據，助力化妝品產品研發、質素提升和升級轉型。
